Derleme Derleme
EÜ Dişhek Fak Derg 2010; 31: 69-81 EÜ Dişhek Fak Derg 2005; 26: 1-5
Dişeti Oluğu Sıvısı (DOS) Elde Etme Sürecine Etki Eden Potansiyel Faktörler Potential Factors Which Affect Gingival Crevicular Fluid Sampling Procedures Hasan HATİPOĞLU Dumlupınar Üniversitesi, Sağlık Hizmetleri Eğitim, Uygulama ve Araştırma Merkezi, Diş Hekimliği Birimi/ Periodontoloji, KÜTAHYA
Özet Dişeti oluğu sıvısı (DOS) kendine özel yapısı nedeniyle periodontal sağlık ve hastalık hakkında bilgi verme potansiyeline sahiptir. Bu yapısı nedeniyle sıvının teşhis basamağında önemli veriler sunabileceği düşünülmektedir. DOS örneklerinin elde edilmesi girişimsel olmayan ve objektif değerlendirmeye izin veren bir süreç olması, bölgesel düzeyde incelemelere olanak vermesi tanısal potansiyelinin önemli bir unsurunu oluşturmaktadır. DOS’un elde edilmesinde kullanılan değişik yöntemler vardır. Her değerlendirme yönteminin kendisine ait avantaj ve dezavantajları mevcuttur. Günümüzde henüz kabul edilmiş ideal DOS örnekleme protokolü mevcut değildir. Son yıllarda ideal bir DOS örnekleme stratejisinin geliştirilmesine yönelik önerilere literatürde sıklıkla rastlanmaktadır. Birçok çalışmada örneklemelerin elde edilmesi sürecinde hacimsel ve içerik değişimlerine neden olabilecek bazı potansiyel faktörlerin gözetilmesi gerekliliğinin altı çizilmektedir. Bu faktörlerden bazıları ana hatlarıyla; DOS elde edilmesi ve hacminin belirlenmesi sürecinde dikkat edilmesi gereken hususlar ve çevresel (buharlaşma, oda sıcaklığı-nem vb.) faktörlerdir. Bu derlemenin amacı DOS’nın elde edilmesi ve değerlendirme sürecinde metodolojik açıdan, sıvıya etki edebilecek potansiyel faktörleri (kısmen veya tamamen kontrol edilebilen-edilemeyen) ele almak ve sistematik olarak irdelemektir. Anahtar sözcükler: Dişeti oluğu sıvısı
Abstract Gingival crevicular fluid (GCF) has the potential to give diagnostic information regarding periodontal health or disease status. GCF collection is a non-invasive, objective and site-specific assessment that can be used for diagnostic purposes. GCF measures are also highly sensitive to sampling techniques. It gives different collection methods to evaluate GCF volume and contents. Each method has its own advantages and disadvantages. A ideal GCF sampling protocol does not exist at the present time. In recent years, the need of an ideal GCF sampling strategy is frequently mentioned. The need for standardization of some factors with the potential for altering volume and content are frequently underlined. Some of these factors are depended on sampling procedures, methods of evaluation of the amount of fluid collected and environmental (evaporation, room humidity and temperature) factors. This review has the purpose to evaluate the factors which has the potential to affect a accurate sampling. Keywords: Gingival crevicular fluid
Giriş Dişeti oluğu sıvısı (DOS) kan plazmasından köken alan,1 dişeti oluğunda farklı komposizyonlarda bulunan2 ve dişeti oluğunun ekolojisini belirleme özelliğine sahip3 eksuda özelliklerini taşıyan bir biyolojik sıvıdır. DOS içeriğindeki hücresel bileşenler (epitel, bakteri, lökositler, eritrositler, lökositler, virüsler ve yan ürünleri),4-6 Kabul Tarihi: 29.03.2011
elektrolitler,7,8 bakteriyel-metabolik ürünler,9,10 sitokinler,11-13 konak ve bakteri kaynaklı enzim ve enzim ürünleri-inhibitörleri (asit fosfataz, alkalen fosfataz, aspartat aminotransferaz, laktat dehidrogenaz, aril sülfataz vb.),7,8,14-18 ve immünoglobulinler19,20 sıvının karakteristik özelliklerini oluşturarak bu sıvının periodontal hastalık acısından önemini ortaya koymaktadır. Öte yandan sistemik olarak alınan ilaçların da
Hatipoğlu
DOS’a21-23 geçtiği ve sıvıyı etkilediği görülmüştür. İmplantların etrafında yer alan peri-implant oluğu sıvısı da DOS’a benzer nitelikler taşımaktadır.24-26 Periodontal patogenezin anlaşılmasında akut yıkım fazlarının belirlenmesi düşüncesi DOS’nda çalışmaların artmasına yol açmıştır.4 DOS’un biyodinamik özelliklerinin günümüzde daha iyi anlaşılması ile bu özelliklere uygun ideal bir örnekleme metodolojisinin geliştirilmesi bu konuyla ilgili çalışmaları hızlandırmıştır.3 Yıllar içinde gelen bilgi birikimine karşın, DOS ile ilişkili olarak henüz açıklanamamış, tanımlanamamış özelliklerin varlığı, aydınlatılması gereken mekanizmaların ve cevaplandırılması gereken soruların bulunduğu görülmektedir.3 DOS hacmi, DOS hacmi ile sıvının içeriği arasındaki ilişki ve buna bağlı olarak veri sunum modellerinin hassasiyetlerine yönelik bilgilerin artması, ideal bir DOS metodolojisinin oluşması bakımından önemlidir. DOS, basit gibi görünen, aslında detaylı ve dikkat gerektiren bir süreç sonunda elde edilmektedir. DOS elde etme sürecinde, DOS’u etkileme potansiyeline sahip birçok faktör mevcuttur (Şekil 1). Seks hormonları, sirkadyen ritim, diyabet gibi sistemik hastalıklar, hasta ile ilişkili faktörleri oluşturmaktadır. Öte yandan DOS örneği üzerine etkisi bulunan, DOS elde etme ve değerlendirme yöntemleri ile bunlara etki eden çevresel (ısı-nem, buharlaşma vb.) faktörler mevcuttur 7. Belirtilen tüm bu faktörlerin etkileri kontrol edilebilir (kısmen veya tamamıyla) veya kontrol edilemez niteliktedir. Bu etmenlerin gözetilerek DOS örneğinin elde edilmesi şüphesiz metodolojik acıdan daha doğru bir yol izlemek anlamına gelecektir. Bu faktörler gözetilerek elde edilen DOS örneğinde hacimsel ve içeriksel etkilerinin bilinmesi, DOS-ilişkili çalışmalarda ideale yakın bir örnekleme sürecinin gerçekleştirilmesi basamağında katkısı olacağı öngörülebilir. Bu derlemede örnekleme öncesi ve esnasında, özellikle DOS elde etme sürecini etkileyebilecek faktörlerin (özellikle kısmen veya tamamen kontrol edilebilir) her biri kendi konu başlığı 70
altında alt başlıkları ve detayları ile birlikte irdelenecektir.
Şekil 1. DOS elde etme sürecine etki eden başlıca faktörler
DOS örneklerinin elde edilmesinde birçok yöntem göze çarpmaktadır (Şekil 2). Her yöntemin kendi içinde avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır. Dolaysıyla araştırmalarda bu husus göz önünde bulundurulmalı ve çalışma tasarımı buna göre oluşturulmalıdır.
Şekil 2. DOS elde etme yöntemleri. DOS örneğinin elde edilmesinde son yıllarda özellikle ticari olarak üretilmiş standart boyut ve emiciliğe sahip kağıt şeritlerin kullanımı ön plana çıkmaktadır.
DOS elde etme yöntemleri I. Kapiller tüp yöntemi: Bu yöntemde belli çap ve uzunluktaki tüpler dişeti oluğuna konumlandırılır ve sıvı aspire edilmeye çalışılır. Egelberg27 bu yöntemi kapiller tü-
EÜ Dişhek Fak Derg 2010; 31: 69-81
pün dişeti oluğuna konumlandırılması sonrasında, tüpün 2–4 kez mezial ve distal yöne hareket ettirilmesi ve bu esnada aspirasyon yapılması şeklinde tarif etmiştir. Kaslick ve ark.28 bu tekniği geliştirmişlerdir. Bu yöntem özellikle DOS’nda hacim artışının beklendiği periodontal hastalıklı bireylerde kullanım alanı bulmaktadır. Bu yöntem ile doğal, seyreltilmemiş DOS elde edilebilmektedir. Ancak DOS miktarının oldukça az olduğu sağlıklı dişetinde sıvının elde edilmesi ve hacim tayinin yapılması oldukça zor olabilmektedir. Diğer bir husus olarak ta DOS’nın viskozitesi sıvı alımını zorlaştırabilmektedir. Küçük hacimli sıvıların elde edilmesi esnasında kapiller tüplerin bölgede uzun zaman konumlandırılması gerekmektedir. Bu durumun sulküler bölgeye travmatik etki yapabileceği bilinmelidir.29 Özellikle bu gibi klinik durumlarda yerleştirilen bu tüplerin, diğer bir DOS elde etme yöntemi olan kağıt şerit yöntemine göre dişeti oluğuna daha fazla travma oluşturabileceği bildirilmektedir.30 II. Dişeti Oluğu Yıkama Yöntemi: Bu yöntemin mantığı, dişeti oluğunun bilinen özellikte ve miktarda bir sıvı ile yıkanması ve geri toplanmasıdır. Bu şekilde hücresel bileşenler ve plazma proteinlerini içeren seyreltilmiş bir DOS elde edilmiş olur. Dişeti oluğu yıkama yönteminde örnekleme bölgesi pamuk rulolar ile izole edilerek özel solüsyonlarla (genelde Hanks solüsyonu) yıkanır ve bir mikro şırınga vasıtasıyla DOS ve bölgeye verilen sıvı geri kazanılır.29,31,32 Bu yöntemde izlenen olumsuzluklar sıvının geri kazanımında ortaya çıkmaktadır. Sıvının yıkama sonrası tam olarak elde edilmesi mümkün olmayabilir. DOS hacmi ve içeriği doğru olarak tayin edilemeyebilir.29 Mevcut diğer dişeti oluğu yıkama yönteminde ise, bireylere akrilikten özel bir plaka hazırlanıp miktarı bilinen solüsyonlarla dişeti oluğu yıkanır ve plakalardaki özel olarak hazırlanmış tüpler vasıtasıyla verilen sıvı geri emilerek, bölgedeki DOS ve plakaya verilen sıvı elde edilir.33 Bu yöntemin zorluğu, her bireye kendisine özel akrilik plaka hazırlanması gerekliliği ile az sayıda bireyden örnekleme yapılabilmesidir. Bu
yöntemde bölgesel çalışılamamaktadır.29 İki yöntemin ortak bir dezavantajı da bu yöntemlerin alt çenedeki kontaminasyon riski nedeniyle sadece üst çene de uygulanabilir olmasıdır.29 III. Kâğıt şerit yöntemi Bu yöntemde DOS elde edilmesi için dişeti oluğu bölgesine farklı şekillerde konumlandırılan kâğıt şeritler kullanılmaktadır. Günümüzde bu yönteme sık başvurulmaktadır. Teknik esas olarak oluk dışı ve oluk içi olarak ikiye ayrılır. Oluk dışı teknikte, kâğıt şerit oluk içine konumlandırılmaz. Bu yöntemde kâğıt şerit genelde dişin bukkal yüzeyine oluk girişine yakın şekilde konumlandırılır.7 Bu yöntemin sulkusa etkisi minimaldir ancak örnekleme süresi uzun ve elde edilen sıvı miktarı azdır.34 Bu yöntemde kâğıt şeridin konumundan dolayı salya ve plak kontaminasyon riski artış göstermektedir.7 Oluk içi yöntemler kendi içinde ikiye ayrılmaktadır. Bunlardan biri derin oluk içi yöntemdir. Bu yöntem uyarınca kâğıt şerit oluk içinde tabanda direnç hissedilene kadar ilerletilmektedir.13,35-37 Diğer oluk içi yöntem olan sığ oluk içi yöntemde kağıt şeritler sulkus girişine (yaklaşık 1 mm derinliğe) konumlandırılmaktadır.11,29,35 Sağlıklı dişetinde cep derinliğinin az olması nedeniyle sığ oluk içi yönteminin derin oluk içi yöntemden farkı kalmamaktadır.29 Kağıt şeritlerin tabana kadar ilerletilmesinin mekanik irritasyonu ve sıvı hacmini artırdığı bildirilmektedir.35,38 Kağıt şeritlerin sulkus içinde ilerletilmesinin epitele zarar verebileceği, bunun da sıvının eksuda özelliğindeki akışını tetikleyebileceği ileri sürülmektedir.39 Oluk içi örneklemenin dento-gingival damarlardaki geçirgenlik reaksiyonlarını daha iyi şekilde ortaya koyabileceği yönündeki bilgi literatürde mevcuttur.40 Bilimsel kaynaklara bakıldığında, DOS elde edilmesi esnasında kağıt şeritlerin dişeti oluğundaki konumu hakkında bilgi vermeyen çalışmalara da rastlamak mümkündür.12,22,41 İdeal DOS örnekleme süresi henüz saptanamamıştır. Örnekleme süreleri literatürde 3 sn,14 5 sn,42,43 15 sn,44,45 20 sn,46,47 25 sn,48 30 sn,30,49-53 1 dk,54 90 sn55 2 dk56,57 ve 3 dk58-60 gibi 71
Hatipoğlu
süreler göze çarpmaktadır. Yine ilgili araştırmalar incelendiğinde, süre konusunda herhangi bir bilgi vermeyen21 veya görsel olarak belli bir DOS miktarı elde edilene kadar örneklemenin devam ettirildiği 61 çalışmalar mevcuttur. Ancak genel kanı örnekleme süresinin uzatılması ile mekanik irritasyon ve kontaminasyon (salya-plak) riskinin arttığı yönündedir.7,35,62 Tekrarlayan DOS örneklemelerinin ele alındığı çalışmalar incelendiğinde, hem örnekleme süreleri.35,50,62,63 hem de örneklemeler arasındaki bekleme süreleri35,50,62,63 arasında belirlenmiş bir standart yoktur. Tekrarlayan DOS örneklemelerinde birçok sıvı bileşeni ilk ölçümlerde en yüksek düzeyde izlenmektedir. Daha sonraki ölçümlerde bileşen miktarlarının azalma trendinde olduğu görülmüştür.62,63 Tekrarlayan DOS örneklemelerinde, DOS hacminin belli bir süre sabit kaldığı daha sonra zaman ile artış gösterdiği belirtilmiştir.53 Bahsi geçen DOS örnekleme yöntemlerinin dışında tanımlanmış başka DOS elde etme yöntemleri (plastik stripler, platin halka, mikrospatüller ve gargara, geliştirilmiş DOS toplama cihazı) mevcuttur.7,64,65 Ancak literatüre bakıldığında bunların günümüzde kullanım alanı dardır. Kâğıt şerit yönteminde DOS hacminin belirlenmesi Kâğıt şeritler ile DOS elde edilmesi sonrasında, sıvı hacminin değerlendirilmesindeki yöntemlerin hassasiyeti, DOS çalışma metodolojisi acısında önemli bir yere sahiptir. a. Kâğıt şeritlerdeki ıslak alanların mikroskop altında incelenmesi: Yüzey alanı belli olan bir kâğıt şeritteki ıslak yüzeyin hesaplanmasını esas alan bir DOS hacim tespit yöntemidir. Doğru bir tespit için elde edilen örnekler ninhidrin (α- amino grubuna özel mavi veya pembe renkte bir boya) ile boyanır ve değişik yöntemlerle (ör: kalibre edilmiş büyütücü camlar altında veya fotometrik-planimetrik teknikler vb.) ıslak alanlar tespit edilebilir.7,29,42,60,66 Yöntemin bir diğer uygulama şekli de sistemik olarak verilen floreseinin (flüoresan bir boya) sulkusta açığa çık72
ması sonucunda, kağıt şeritler ile elde edilen DOS örneklerinde, mevcut ıslak alanların ültraviyole ışık altında incelenmesidir.29,67 Bu yöntemin dezavantajları değerlendirmelerin hasta başında yapılma zorluğu, değerlendirmeye kadar geçen sürede örneklerde buharlaşma meydana gelmesidir. Kimyasal işleme maruz kalan örneklerin başka incelemeye olanak vermemesi diğer bir olumsuz yönü oluşturmaktadır.29 b. Kâğıt şeritlerin tartılması Genişliği/uzunluğu belli olan kağıt şeritlerin DOS örneklemesi öncesi ve sonrasında ağırlıkları hassas bir tartı vasıtasıyla tespit edilerek DOS miktarı hesaplanabilir.7,11,43,68 Bu yöntemde çok küçük miktardaki DOS için hassas bir tartı aletinin gerekli oluşu ve buharlaşmanın DOS hacmini değiştirebilmesi bu yöntemin olumsuz kısımları olarak sayılabilir.7,29 c. Periotron aygıtı ile DOS hacminin belirlenmesi: Periotron, DOS hacmini elektriksel olarak tespit eden bir cihazdır. Cihaz, elektriksel kapasitans değişimleri ile kâğıt şeritteki DOS miktarını belirler. Hızlı ve hassas bir tekniktir.29 Literatür incelendiğinde gelişim dönemlerine göre üç farklı Periotron cihazının çalışmalarda kullanıldığı görülmüştür. Bunlar farklı üreticilerce imal edilen: HAR–600® (Harco Electronics Ltd., Winnepeg, Kanada),14,69 Periotron 6000® (IDE Interstate, Amytville, N.J., ABD-Siemens Medical Systems Inc., Iselin, N.J, ABD-Harco Electronics Ltd., Winnepeg, Kanada) 50,58,61,70 ve Periotron 8000®’dir (Proflow Inc, Amityville, N.Y., ABDOraflow Inc, Plainview, N.Y, ABD).48,49,71,72 DOS hacminin tayininde, Periotron cihazı kullanıldığında belli başlı durumlar uygulamayı etkileme potansiyeline sahiptir. Bunlar, cihaz kalibrasyonu ile ilgili hususlar, örneklemelerde kullanılan kağıt şeridin özellikleri ile cihaz ve örnekleme sahasına etki eden kontaminasyon, buharlaşma ile ısı ve nem gibi çevresel etmenlerdir. Kalibrasyon; Periotron için, sıvıların bilinen hacimlerinin (hassas bir şırınga ile kağıt şeritlere
EÜ Dişhek Fak Derg 2010; 31: 69-81
uygulanmasıyla) alete okutulup tanıtılması, bu işlem sonucunda bir kalibrasyon eğrisinin oluşturulması ve bu kalibrasyon eğrisi yardımıyla da DOS hacminin (Periotron ünitesi (PÜ) veya mikrolitre (μl) cinsinden) belirlenmesidir.73,74 Kalibrasyon DOS hacmi ölçümlerinde kritik bir aşamadır. Bu aşamadaki eksikler veya hatalar küçük hacimlerde yüzde olarak ciddi ölçüm farklılıklarına ve hatalara neden olur. Her cihazın kalibrasyonunun farklı değer aralığında olduğu, her cihazın kendine has bir kalibrasyona ihtiyaç duyduğu, serumun kalibrasyon eğrisi oluşturma sürecinde en uygun sıvı olduğu ve kalibrasyon eğrisi oluşturulurken tekrarlayan hacimsel ölçümlere ihtiyaç duyulduğu bilinmelidir.29 Cihazlar arasında PÜ’nün μl’ye çevrilmesinde yöntem bakımından farklılıklar mevcuttur. Periotron 6000® cihazında manuel formüllerden yararlanarak mevcut PÜ değeri μl’ye çevrilmektedir.21 Bu durum çok küçük DOS hacimlerinde (≈ 0-10 PÜ) analiz sorunlarını beraberinde getirdiği rapor edilmiştir.75 Periotron 8000® cihazında bu aşama bir bilgisayar programı vasıtasıyla gerçekleştirilmektedir.73 Bazı çalışmalarda DOS hacimsel değişimlerinin mikrolitreye çevrilmediğini, sonuçların sadece PÜ cinsinden verildiği görülmektedir.76-78 Kalibrasyon esnasında kullanılan sıvılarında okuma değerleri üzerinde etkili olduğu görülmüştür. Kalibrasyonda kullanılacak sıvının DOS ile benzer özelliklere sahip olması gerektiği,73 insan serumunun mevcut özellikleri7,29,73 nedeniyle kalibrasyonda tercih edilebileceği öne sürülmüştür.73 HAR-600® Periotron modeliyle yapılan bir araştırmada, kalibrasyonda kulanılan distile suyun en yüksek, serumun ise en düşük okuma değerini ortaya koyduğu belirtilmiştir.69 Yine sıvılardaki yüksek protein değerlerinin Periotron değerlerinde düşmeye neden olduğu bildirilmiştir.73 Cihazlar arasında kalibrasyon eğrilerinin oluşturulmasında farklılıklar mevcuttur. Örneğin HAR-600® ile aynı üreticinin 6000® modeli ile yapılan karşılaştırmalı bir araştırmada, 6000 modelinin kalibrasyon eğrisinin küçük sıvı miktarlarında HAR 600®’e göre daha hassas olduğu belirlenmiştir.79
Cihaz kalibrasyonunun belli dönemlerde gözden geçirilmesi gerekmektedir. Bu konuda farklı uygulamalar mevcut olup, aygıtın her kullanım öncesinde kalibre edilmesi gerektiğini53,80-82 veya hafta da bir kontrol edilip kalibrasyon eğrisinin tekrar elde edilmesi şeklinde73,83 öneriler de mevcuttur. Öte yandan Periotron cihazının kullanıldığı ancak kalibrasyon konusunda ayrıntı vermeyen çalışmalara da rastlamak mümkündür.77,84 Deinzer ve ark.48 kalibrasyonda 5 PÜ’lik bir güvenlik aralığı uygulamasına gitmişlerdir. Bu yöntem uyarınca yeni örnekleme öncesi Periotron cihazının mevcut kalibrasyonu kontrol edilmekte, kalibrasyonun kontrol edilmesi maksadıyla okutulan değerlerde 5 PÜ’lik bir sapmada kalibrasyon yenilenmektedir. Kalibrasyon eğrisinin oluşturulma sürecinde her μl için kullanılan sıvıların farklı sayıda örnekleri cihaza okutulduğu ve bunların ortalamalarının alındığı görülmüştür. Bu alanda kabul edilmiş herhangi bir standart bulunmamaktadır. Çalışmalarda bu amaçla 2 kez,29 3 kez,30,74 5 kez48 veya 10 kez85 tekrarlanan ölçümler söz konusudur. Tözüm ve ark.71 kalibrasyon eğrisinin oluşturulmasında yaptıkları deneysel çalışmada 3, 5 ve 20’lik ölçüm serileri arasında belirgin bir fark tespit edememişlerdir. Çalışmalar irdelendiğinde ideal kâğıt şerit tipi konusunda henüz bir uzlaşma sağlanamadığı görülmektedir. Çalışmalarda genellikle Whatman tipi filtre kâğıtları74,86,87 veya ticari olarak üretilen boyutları ve emicilikleri standart olan kâğıt şeritlerin17,37,50,88,89 kullanıldığı görülmektedir. Önemli olmasına rağmen bu konuya bazı çalışmalarda değinilmemiştir.11,90 Griffiths ve ark.87 tarafından gerçekleştirilen ve Periotron 6000®’ nin kullanıldığı bir çalışmada, değişik ebattaki kâğıt şeritler değerlendirilmiş olup ideal kâğıt şerit tipi ve boyutu tespit edilmeye çalışılmıştır. Çalışmada standart boyut ve emiciliğe sahip ticari olarak üretilmiş kâğıt şeritler ile Whatman 1, Whatman 3MM, Whatman 4 kromatografi kâğıtları ve boyut olarak ta 1x5 mm, 2x5 mm, 3x5 mm, 4x5 mm, 1x8 mm, 2x8
73
Hatipoğlu
mm, 3x8 mm’lik boyutlar değerlendirilmiştir. Emicilik özellikleri göz önünde bulundurulduğunda, örnekleme için en uygun kâğıt türünün Whatman 3MM kromatografi kâğıdının olduğu, Periotron kutup çapları göz önünde bulundurulduğunda da en fazla absorban özelliği 2x8 mm’lik kâğıt şeridin sergilediği görülmüştür. Yine aynı çalışmada küçük hacimli örneklerde (